91porn y 长链非编码RNA LINC02163在肝细胞肝癌中抒发上调并促进肝癌细胞迁徙和侵袭
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肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一种常见的消化说念恶性肿瘤，其物化率高居恶性肿瘤第3位[1]。我国每年死于肝癌的东说念主数约38.3万，占世界肝癌物化东说念主数的51%[2]，严重要挟我国东说念主民健康。近几十年来，尽管HCC在手术颐养、放化疗以及分子靶向颐养等方面取得了很猛进展，但由于高侵袭性、高鼎新性及高复发等特质，HCC患者预后差的近况仍未发生根底变嫌[3]。因此，探讨肝癌侵袭鼎新的机制，寻找灵验的会诊分子记号物和颐养靶点成为现在HCC洽商的蹙迫处所。
长链非编码RNA (lncRNA)是转录本长度大于200个核苷酸而不具备卵白质编码功能的RNA分子[4]，其不错RNA的容貌参与X染色体千里默、基因组钤记、染色质修饰、转录防止、转录激活和核内运输等多种生物学活动[5]。洽商标明，lncRNA在肿瘤侵袭鼎新中领会蹙迫的调控作用[6]，如ATB[7]、HOTAIR[8]和MVIH[9]可促进HCC的侵袭鼎新，而H19[10]可扼制HCC的侵袭鼎新。本洽商前期通过生物信息学分析，筛选到1条可能对肝癌发生、发展起蹙迫作用的lncRNA LINC02163(Ensembl ID: ENSG00000251026)。DONG等[11]洽商指出，LINC02163在胃癌中领会致癌基因的作用。然而，LINC02163在肝癌中的抒发过甚作用国表里尚罕有相关报说念。因此，本洽商旨在探讨LINC02163在肝癌组织及细胞系中的抒发情况，分析其与临床病理参数之间的关系，过甚对肝癌细胞迁徙、侵袭智商的影响。
1 材料与要领 1.1 材料与试剂 1.1.1 细胞系东说念主肝癌细胞系HuH-7、HCCLM3、MHCC-97H、SNU-182、SMMC-7721以及东说念主闲居肝细胞系L02均购自中国科学院上海人命科学洽商院干细胞库。
足交telegram 1.1.2 组织标本蚁合2017年10月至2019年5月陆军军医大学第一从属病院HCC患者手术切除标本60例。其中男性49例，女性11例；年事24~74岁，中位年事53岁。入选圭臬：患者术前未进行放化疗、射频消融颐养，术后标本经病理组织学检考据实为HCC。摈弃圭臬：其他类型肝肿瘤。临床病理参数包括：患者的性别、年事、肝硬化、AFP抒发水平、肿瘤直径、数量、病理分级、TNM分期和微血管滋扰(MVI)情况。对照组标原来自于消释患者的癌旁组织，距离手术切缘至少2 cm，且术后病理搜检未发现癌细胞。所蚁合的簇新标本于离体30 min内蚁合，立即冷冻于液氮中，并放手于-80 ℃超低温雪柜中保存。本洽商经陆军军医大学伦理委员会批准现实，标本检测在整个洽商对象签署知情欢跃书后进行。
1.1.3 试剂RPMI1640培养基、DMEM培养基购自Gibco公司，胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物有限时代公司，0.25%胰酶购自HyClone公司，TRIzol、LipofectamineTM 2000转染试剂购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒均购自TaKaRa公司，Matrigel基质胶购自Corning公司，结晶紫溶液购自碧云天公司，siRNA购自上海吉玛公司，引物由上海生工公司合成。
1.2 要领 1.2.1 细胞培养肝癌细胞系HuH-7、HCCLM3、MHCC-97H及闲居肝细胞系L02复苏后置于含10%胎牛血清的DMEM培养基，SMMC-7721、SNU-182置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养，细胞贴壁滋长，隔天换液，3~5 d胰酶消化传代。
1.2.2 细胞转染取对数滋长期肝癌细胞，用0.25%胰酶消化，调整细胞至一定浓度，接种于6孔板。待其密度为50%~70%时用5 μL LipofectamineTM 2000永别转染5 μL LINC02163 siRNA-18(si-18)和5 μL LINC02163 siRNA-151(si-151)至防止组肝癌细胞中。si-18序列正义链：5′-GCAGAAACGUGUUGUAUUUTT-3′；反义链：5′-AAAUACAACACGUUUCUGCTT-3′。si-151序列正义链：5′-GCAACCAGUAGCAAAUUAUTT-3′；反义链：5′-AUAAUUUGCUACUGGUUGCTT-3′。阴性对照组加入与实验组等量的LipofectamineTM 2000和siRNA-NC(si-NC)。si-NC序列正义链：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；反义链：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。将细胞分为3组，永别是防止组(si-18)、防止组(si-151)及阴性对照组(si-NC)。转染后培养箱中惯例培养，6 h后换成含双抗培养基，48 h后蚁合3组细胞进行qRT-PCR检测转染效果等后续实验。
1.2.3 组织和细胞总RNA提真金不怕火遴荐TRIzol法提真金不怕火RNA的具体模范为：从液氮中取出肝癌组织，用无RNA酶的刀片切下50 mg阁下标本，加1 mL TRIzol，用组织研磨仪幻灭，加入200 μL氯仿，极度混匀，冰上放手15 min后，4 ℃下12 000 r/min离心15 min，取400 μL上清液至无RNA酶的EP管中，加400 μL异丙醇千里淀，然后加入适量DEPC水融化。细胞总RNA的提真金不怕火参考文件[12]报说念的要领。对获取的总RNA遴荐分光光度仪检测浓度和纯度，并搜检总RNA完好性。
1.2.4 逆转录和及时荧光定量PCR取1 μg总RNA按TaKaRa公司的逆转录试剂盒领会书进行逆转录反映得到cDNA，-20 ℃保存。以cDNA为模板进行qRT-PCR合成扩增看法基因，以β-actin当作内参基因。反映体系25 μL，包括cDNA模板1 μL，高卑劣引物各1 μL，TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL，DEPC水9.5 μL。反映要求为95 ℃预变性30 s; 95 ℃变性5 s，60 ℃退火蔓延30 s，共40个轮回。LINC02163上游引物：5′-TGATGCTGTTGTGTCCAGAATTG-3′；LINC02163卑劣引物：5′-CACTAGGGTCCGCAGCTTTA-3′；β-actin上游引物：5′-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3′；β-actin卑劣引物：5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′。遴荐相对定量法，测定看法基因、内参基因的PCR居品的Ct值，代入公式(即ΔCt=Ct看法基因－Ct内参基因，ΔΔCt=ΔCt实验组－ΔCt对照组)，以2－ΔΔCt贪图LINC02163的相对抒发量。整个反映设3个复孔，实验重迭3次。
1.2.5 Transwell小室细胞侵袭实验实验分组同细胞转染实验。将Matrigel基质胶与预冷的无血清培养基按1 :8比例稀释。取60 μL稀释的基质胶均匀铺于Transwell上室内，于37 ℃培养箱中放手60 min。取3组细胞，加入胰酶消化，无血清的培养基制成8× 105/mL的细胞悬液，每个Transwell上室中加入100 μL细胞悬液，下室内加入550 μL含10%胎牛血清的培养基(疑望幸免气泡产生)。培养24 h后取出Transwell上室，用棉签擦去上室里面未穿过PC膜的细胞。无水甲醇固定30 min，0.1%结晶紫溶液染色15 min。极度显微镜下(×200)就地中式5个视线拍照，计数染色的穿膜细胞数。每组细胞设3个复孔，实验重迭3次。
1.2.6 Transwell小室细胞迁徙实验将Matrigel基质胶包被的小室换成不含基质胶的小室，其余模范同侵袭实验。
1.3 统计学分析应用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。计量贵府若征服正态漫步，两组间比较遴荐t磨砺；若非正态漫步，配对样本遴荐Wilcoxon象征秩磨砺，两孤独样本遴荐Mann-Whitney U磨砺。计数贵府比较遴荐χ2磨砺。磨砺水准：α=0.05。
2 适度 2.1 LINC02163在肝癌组织中的抒发经qRT-PCR检测肝癌以过甚配对癌旁组织标本中LINC02163的抒发，适度标明：与配对癌旁组织比拟，LINC02163在肝癌组织中的抒发彰着升高，各别有统计学兴致(P < 0.001，图 1)。
2.2 LINC02163的抒发与HCC患者临床病理参数之间的关系为了考据LINC02163在肝癌发生、发展经由中的作用，进一步分析LINC02163与肝癌临床病理参数之间的关系。将纳入洽商的60例病例按照HCC组织的LINC02163相对抒发量次序排序，并按中位数要领分为高抒发组及低抒发组各30例。用χ2磨砺永别考据两组间临床一般情况及病理参数各别有无统计学兴致。适度透露，LINC02163的抒发水平与性别、年事、肝硬化、AFP抒发水平、肿瘤直径、数量、病理分级等无彰着相关性，而与肿瘤TNM分期和微血管滋扰(MVI)有权贵的关联(P < 0.01，表 1)。比拟临床早期或无微血管滋扰的患者，LINC02163的抒发在临床晚期(Ⅲ~Ⅳ期)或有微血管滋扰患者中彰着升高(P < 0.01，图 2)。
2.3 LINC02163在肝癌细胞系中的抒发遴荐qRT-PCR检测了LINC02163在肝癌细胞系及东说念主闲居肝细胞系L02中的抒发情况，适度透露，与L02比拟，LINC02163在HuH-7、HCCLM3、MHCC-97H、SNU-182和SMMC-7721细胞系的抒发量均上调；在HuH-7和HCCLM3细胞系中相对高抒发，而在SMMC-7721细胞系中相对低抒发(P < 0.001，图 3)。基于以上适度，咱们弃取HuH-7、HCCLM3细胞系为后续敲低实验洽商对象，继而洽商LINC02163对肝癌细胞系生物学功能的影响。
2.4 用RNA防止时代可扼制LINC02163在肝癌细胞中的抒发将si-18、si-151、si-NC永别转染HuH-7、HCCLM3细胞系防止LINC02163的抒发48 h后，用qRT-PCR检测防止效果。适度透露，与转染了si-NC的对照组比拟，转染了si-18、si-151的实验组细胞HuH-7、HCCLM3中LINC02163的相对抒发量彰着低于si-NC对照组(P < 0.01，图 4)，指示扼制抒发得手，该两条siRNA可用于后续实验对LINC02163的敲低。
2.5 敲低LINC02163抒发对肝癌细胞迁徙的影响应用Transwell迁徙实验检测敲低LINC02163抒发对HuH-7、HCCLM3细胞迁徙智商的影响，在无基质胶的要求下，不雅察敲低LINC02163抒发的实验组与对照组穿过小室细胞的数量。该实验适度透露，HuH-7与HCCLM3实验组迁徙细胞数彰着少于对照组，各别有统计学兴致(P < 0.01，图 5)，标明敲低LINC02163抒发不错权贵扼制肝癌细胞的迁徙智商。
2.6 敲低LINC02163抒发对肝癌细胞侵袭的影响应用Transwell侵袭实验检测敲低LINC02163抒发对HuH-7、HCCLM3细胞侵袭智商的影响，在有基质胶的要求下，不雅察敲低LINC02163抒发的实验组与对照组穿过小室细胞的数量。该实验适度透露，HuH-7与HCCLM3实验组侵袭细胞数彰着少于对照组，各别有统计学兴致(P < 0.01，图 6)，标明敲低LINC02163抒发不错权贵扼制肝癌细胞的侵袭智商。
3 商讨由于HCC发病归隐，大大齐患者被会诊时因一经浸润并发生远方鼎新而失去根治性手术契机，此外肝癌细胞侵袭鼎新智商强是导致HCC手术颐养失败和复发的蹙迫原因[11-13]。因此，洽商HCC细胞侵袭鼎新的分子机制，对寻找新的阻断颐养靶点以裁汰HCC细胞鼎新风险具有蹙迫兴致。LncRNA因其枯竭完好的灵通阅读框，不参与卵白质编码功能，曾被以为是基因组转录经由中产生的“杂音”和“垃圾”而不受东说念主们有趣[14]。频年越来越多的洽商标明，lncRNA天然不可编码卵白质，但其平凡参与机体的生理与病理经由，在表不雅遗传水平、转录和转录后水平调控基因的抒发。在肝癌的侵袭鼎新经由中lncRNA领会着至关蹙迫的作用。HOTAIR梗概通过扼制RNA聚合区域卵白38 (RBM38)的抒发促进肝癌细胞的迁徙和侵袭[15]。MVIH不错通过下调磷酸甘油酸激酶1(PGK1)相投血管生成，从而促进肝癌细胞鼎新[9]。ATB通过与miR-200家眷竞争性聚合上调ZEB1和ZEB2卵白的抒发，从而相投上皮-间质鼎新(EMT)和肝癌侵袭[7]。H19梗概通过增多组卵白乙酰化激活miR-200家眷，从而促进间质-上皮鼎新(MET)，扼制肝癌细胞的迁徙和侵袭[10]。
LINC02163是一个新近发现的基因间lncRNA分子，位于东说念主类染色体5q21.2区域，全长316 bp，包含3个外显子。DONG等[11]洽商发现LINC02163在胃癌中呈高抒发，且与胃癌患者的不良预后相关。而且在体外试验中发现，下调LINC02163抒发后，胃癌细胞的增殖、侵袭智商松弛。在裸鼠体内试验中，LINC02163低抒发的胃癌细胞在裸鼠皮下成瘤质地权贵减小，肺鼎新瘤数量也权贵减少。进一步洽商其机制发现LINC02163通过miR-593-3p/FOXK1信号轴介导了胃癌细胞的滋长和鼎新。基于TCGA数据库分析，LINC02163在肝癌组织中亦高抒发，这指示咱们去探究LINC02163在临床肝癌样本和细胞系中的抒发水平过甚具体作用。
本洽商遴荐qRT-PCR检测LINC02163在60例HCC组织和配对癌旁组织中的各别抒发，以及5种肝癌细胞系与闲居肝细胞系中的各别抒发。发现与癌旁组织和闲居肝细胞比拟，LINC02163在肝癌组织和细胞中抒发均彰着升高(P < 0.001)，在肝癌细胞系HuH-7和HCCLM3中的上调幅度彰着，该适度指示LINC02163与肝癌发生、发展相关，可能参与了肝癌的癌变经由。进一步分析LINC02163的抒发与HCC患者临床病理参数间的关系后发现，其抒发水平与TNM分期、是否微血管滋扰(MVI)联系(P < 0.01)，但与性别、年事、肝硬化、AFP抒发水平、肿瘤直径、数量、肝癌的分化进度等无关，高LINC02163抒发患者可能有较高的TNM分期、较大的微血管滋扰(MVI)概率。已有洽商[16]标明，MVI是肝癌患者术后复发及鼎新的高危要素。上述适度指示，LINC02163与肝癌进展密切相关，很可能参与了肝癌的侵袭鼎新经由。
为了进一步考据LINC02163是否参与调遣肝癌细胞的迁徙及侵袭经由，在体外实验中本洽商弃取LINC02163相对较高抒发细胞系HuH-7及HCCLM3当作洽商模子。咱们应用siRNA时代特异性下调LINC02163抒发，不雅察其对这两种肝癌细胞生物学功能的影响。Transwell实验适度透露，下调LINC02163抒发能权贵扼制HuH-7及HCCLM3细胞的体外迁徙、侵袭智商(P < 0.01)。以上适度领会，在HCC中LINC02163具有调控肝癌迁徙和侵袭智商，可能是一种促进肝癌侵袭鼎新的致癌基因，这种作用与以往LINC02163在胃癌中的洽商适度相一致[11]。
综上，本洽商证据LINC02163在HCC中高抒发，况兼与HCC的TNM分期、MVI密切相关，可能通过促进肝癌侵袭鼎新领会致癌基因的作用。这标明LINC02163可能成为肝癌会诊的生物记号物和肝癌防治的新靶点。因此91porn y，鄙人一步的实验中咱们将通过裸鼠体内实验考据这一适度，并探究LINC02163领会促癌作用的具体信号通路，以期为进展肝癌的分子机制及发现新的诊治要领奠定一定的表面基础。