奇米影视777 陈鹏/樊新元团队与相助者开采生物正交“色氨酸脱笼”时期助力上万潜在卵白的特异激活
因其私有的结构，色氨酸是卵白质中介导分子相互作用类型最多、也最“崇高”的自然氨基酸，其生物合成的“老本”远超其他自然氨基酸，且只由UGG一个密码子编码。【1】由于色氨酸的私有性和稀缺性，色氨酸经常出当前卵白质的关节位点，自在卵白质结构、转变卵白质构象、调控卵白质相互作用、参与分子识别和催化等高大经过。【2—3】要是约略在活细胞内精确主管特定色氨酸的功能及相互作用奇米影视777，就有望获取一种特异激活含色氨酸卵白质的通用时期。然而当前尚无对色氨酸进行“可逆化学裁剪”的相关报说念。
2024年2月28日，北京大学陈鹏/樊新元团队与浙江大学林世贤团队相助，在Nature Chemistry杂志在线发表了题为“Genetically encoded bioorthogonal tryptophan decaging in living cells”的相干论文。该相干开采了一种能在活细胞中“笼锁”和“脱笼解锁”卵白质中淘气色氨酸功能的通用方法（Trp-CAGE，图1）。该方法利用基因密码子推广时期将“笼锁”色氨酸（Caged Tryptophan）引入认识卵白的特定位点，收尾其功能的暂时屏蔽；然后，利用新发展的生物正交剪切响应在活细胞中完成可控 “脱笼”，收尾万般卵白质家眷的精确“激活”和功能理解。通过预备机模子展望，该“色氨酸脱笼”时期可对向上28，000个来自不同物种的候选卵白质进行功能获取性相干。
论文截图
陈鹏课题组永久竭力于发展适用于活细胞的生物正交响应，在国外上率先漠视并发展了生物正交剪切响应【4】，即通过对认识卵白关节残基的保护-脱保护，收尾对其活性的原位“关-开”调控（即笼锁-脱笼，caging-decaging）。这种方法普适性广，对卵白结构调动小，不错最猛进程还原自然卵白的活性。在前期的相干职责中，陈鹏课题组将生物正交剪切响应应用于多种氨基酸残基的脱笼，在活细胞中收尾了不同种类酶活性的原位、瞬时激活【5—8】。“色氨酸脱笼”是其课题组在生物正交剪切响应规模的全新冲破。
图1. 色氨酸“笼锁-脱笼”（Trp-CAGE）战术的暗示图
在相干中，相干东说念主员最初想象了能防止确切整个色氨酸相互作用的非自然氨基酸，并发展了与之配套的生物正交剪切响应。相干东说念主员在色氨酸的吲哚氮原子上引入一个格外的π系统（乙烯基），通过共轭效应收缩了吲哚环的π能量，从而同期阻断了色氨酸的极性相互作用、疏水相互作用和π相互作用（图2）。此外，相干东说念主员还防备到乙烯基的HOMO轨说念能量因共轭作用而高潮，使其参与逆电子需求的狄尔斯-阿尔德响应（IEDDA）的活性增强。基于这一发现，相干东说念主员开采了首个针对吲哚类结构的IEDDA-剪切响应。该响应可在PBS溶液中自在进行，约略在30分钟内以大于80%的收率得到脱笼居品。
图2. 非自然氨基酸的想象及生物正交剪切响应的发展
接下来，相干东说念主员采取了遗传密码子推广战术以位点特异性的方式将“笼锁”色氨酸（N-乙烯基色氨酸，vyW）引入卵白质中，并采取了“级联进化”的战术对嵌合体苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶（chPheRS）加以进化筛选【9】。最初，他们取舍了一种与vyW化学结构相通且只出入一个碳原子的过渡化合物N-甲基色氨酸（1MW）。通过定向进化筛选，到手获取了约略识别1MW的突变体（1MWRS），并成就了1MW和vyW与这些突变体之间的对接模子。基于对接模子的不同，相干东说念主员有针对性地对1MWRS进行了三个关节残基的突变，并最终到手已然出一种高效准确识别vyW的氨酰-tRNA合成酶（vyWRS）（图3）。随后，相干者们利用模子卵白质在体外以及活细胞中评估了脱笼响应的后果。推行猖狂显现，关于体外纯化的模子卵白质-GFP上的vyW，其脱笼后果可向上>90%，而在活细胞中，使用Renilla Luciferase (RLuc)说明系统评估的脱笼后果达到了54%。
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图3. 氨酰-tRNA的进化及Trp-CAGE在体外及活细胞中的考据
在此基础上，相干东说念主员成就了卵白质激活的通用平台。通过在PDB数据库中使用新建的算法来搜索含相过失色氨酸的卵白质，发现向上28，000个卵白质的色氨酸-配体距离在5Å以内。这标明这些卵白质不错通过色氨酸脱笼时期进行功能相干。色氨酸残基在卵白质中的化学相互作用不错归类为五种主要类型，包括氢键作用、疏水相互作用、金属联接、π-π堆积和阳离子-π相互作用。相干东说念主员针对每种相互作用挑选了示例卵白，并到手使用Trp-CAGE战术“千里默”和“复原”了相应的卵白质功能。Trp-CAGE战术的应用规模平方，不错精确调控多种卵白质的生理经过，包括别构作用、卵白质练习经过、酶活口袋调控，卵白质-RNA相互作用以及卵白质-卵白质相互作用等。该战术适用于各式卵白质家眷，包括荧光卵白（用于生物标记和显微镜相干）、金属联接卵白（参与金属离子的配位和催化响应）、激酶（调控信号传导通路）、荧光素酶（用于生物发光推行）、翻译肇始因子（转变卵白质合成）和翻译后修饰读取卵白（参与卵白质修饰）等。通过Trp-CAGE战术，这些卵白质的功能不错被精确的调控和相干（图4）。
图4. 基于Trp-CAGE战术的通用型卵白质激活平台
相干东说念主员进一步状貌了利用Trp-CAGE来调控表不雅遗传“阅读器”卵白与组卵白的相互作用。从PDB数据挖掘中，相干东说念主员分歧细则了27个、134个和133个含有赖氨酸单甲基化、双甲基化和三甲基化的识别结构域中含相过失的色氨酸。这些结构域不错识别组卵白H3上K4、K9、K27和K36位点的赖氨酸甲基化【10】。相干阐明，Trp-CAGE战术不错在体外以及活细胞中调控整个采取的阅读结构域（包括PHD、Chromo、BAH和Tudor结构域）与组卵白H3上的四个甲基化赖氨酸位点（K4、K9、K27和K36）之间的相互作用（图5）。
图5. 在活细胞中调控表不雅遗传读码卵白
综上，该职责发展了一种私有且通用的色氨酸脱笼方法，用于“化学”激活卵白质特定位点上的色氨酸，以收尾相应卵白质的功能获取性相干。该相干以共轭化学动作想象想路，使用乙烯基动作保护基团，通过共轭吲哚的π系统到手地阻断了色氨酸的确切整个相互作用类型。这种私有的保护基团不错通过生物正交剪切响应速即脱除，收尾对活细胞内卵白质的及时、原位激活。更令东说念主隆盛的是，该战术具有平方的适用性，不错主管各式不同类型的卵白质，包括荧光卵白、金属联接卵白、激酶、荧光素酶、翻译肇始因子和组卵白翻译后修饰阅读卵白等。字据预备展望，该战术不错在向上28，000个候选卵白质上进行生物正交激活调控，展示了其巨大的应用后劲。这一冲破为探索和长入卵白质功能提供了全新的器具。
北京大学陈鹏/樊新元课题组博士后朱玉超、浙江大学林世贤课题组博士后丁文龙为论文的共同第一作家，陈鹏解说、林世贤相干员和樊新元副相干员为论文的共同通信作家。该相干获取了国度重心研发预备、国度当然科学基金、北京市当然科学基金、北京分子科学国度相干中心、新基石相干员预备、生物医学峰基金以及博士后翻新东说念主才救济预备的资助。
参考文件：
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